용도에 의한 분류

• 생물현미경
• 금속현미경
• 측정현미경
• 실체현미경

형태에 의한 분류

• 정립형 현미경
• 도립형 현미경

기능에 의한 분류

• 명시야 현미경
• 암시야 현미경
• 편광 현미경
• 미분간섭 현미경
• 위상차 현미경
• 형광 현미경
• 공초점 현미경

그외 현미경

• 적외선 현미경
• 자외선 현미경
• X선 현미경
• 전자현미경
• 원자 현미경

현미경 교육 사이트 개설 취지

www.microscopy.co.kr

이 사이트는 현미경에 대한 궁금증을 해결하는데 있어서, 도움이 되고자 하는 교육 목적으로 준비하고 있는 사이트입니다만, 현업에서의 경험을 포함하는 상업 사이트로서의 성격도 포함하고 있습니다.

Site 관리자 – 진재환 올림

E-mail : jhjin@jnoptic.com

광학 현미경의 역사

단렌즈 현미경 – Single Lens Microscope

복식현미경 – Compound microscope

가시광선을 주로 사용하는 광학 현미경은 상기와 같이 단렌즈 현미경으로 시작하여 대물렌즈와 접안렌즈를 조합하여 사용하는 복합현미경의 모습으로 기본 구조를 갖추어 왔습니다. 또한 보다 높은 배율을 추구할 수록 흐려지는 이미지의 질을 높이기 위한, 수 많은 시도의 결과로 현재 우리는 양질의 이미지를 볼 수 있는 현미경을 사용할 수 있습니다.

또한 일반인이 흔히 알고 있는 광학현미경은 Bright Fileld 라고 불리는 관찰법으로써 설명 할 수 있습니다. 하지만, 이 관찰법만으로는 다양한 샘플을 보고자 하는 탐구자들의 욕구를 만족시키기 어렵기 때문에, 보다 다양한 관찰 방법이 개발되어 왔고, 향후에도 새로운 관찰법이 끊임없이 개발될 것으로 기대됩니다.

참고로, 오늘날의 대표적인 현미경 관찰법을 열거하자면 BF, DF, PO, Simple PO, DIC, PH, FLUORESCENCE 등을 들수 있습니다.

전자 현미경

SEM ; Scanning Eelectron Microscope

원자 현미경

AFM ; Atomic Force Microscope

쾰러 조명 장치

관찰하는 샘플의 전체 Field of View에서 밝고 균일 한 조명을 구현하기 위해서 사용되는 일반적인 조명 방법입니다. ( Köhler illumination )

조명 광원이 광학계의 내부에서 결상을 하게 되어 있습니다. 예전에 사용되었던 크리티컬 조명에서는 샘플의 상에 조명광원의 필라멘트 상이 겹쳐서 보이게 됩니다만, 쾰러 조명은 조명의 결상 위치를 무한보정 대물렌즈의 후초점면에 위치하도록 유도함으로서 샘플의 상에 광원의 상이 중복되는 문제점을 해결 하면서, 동시에 샘플 전체에 균일한 조명을 조사하는 것이 가능해 졌습니다.

현미경의 사용에 있어서 가장 중요한 포인트

현미경의 모든 관찰법은 상기와 같은 쾰러 조명을 기반으로 설계되어 있습니다. 따라서 쾰러 조명의 세팅 또는 설정이 틀어져 있는 상태에서의 현미경의 관찰은 그 설계 목적을 완전히 벗어나 있는 현미경 관찰을 하게 되는 것이며, 사용중이라고 생각하는 본래의 관찰법과는 상이한 알 수 없는 관찰법으로 샘플을 관찰 하는 비효율적인 경우가 빈번하게 발생되고 있습니다.

쾰러 조명에 대한 명칭을 생소하시게 느껴지신다면, 독자께서는 지금까지 현미경의 중요한 포인트를 제대로 알지 못하고 사용하시고 계셨을 가능성이 있습니다 . 바이오 이미징을 하시는 관찰자께서는 사용하시는 현미경의 쾰러 조명 설정이 제대로 되어있는지 반드시 확인하실 필요가 있습니다.

다만, 반사용 현미경을 주로 사용하시는 산업계 현미경 사용자 분들은 이러한 쾰러 조명의 잘못된 설정으로 받는 영향이 상대적으로는 적습니다. 그 이유로는 반사관찰을 위주로 하는 현미경에서는 대물렌즈 자체가 콘덴서 역할을 하기 때문에 쾰러 조명을 설정하기 위해서 콘덴서 위치 교정이 따로 필요하기 않기 때문입니다.

반사형 조명을 사용하는 현미경에서는 샘플에 초점을 맞추면, 그 자체로 콘덴서의 높이 설정이 완료되고 ( X, Y, Z축 위치 설정 ), Field 조리개(diaphragm)와 Aperture 조리개(diaphragm)의 설정(XY축 교정)이 상대적으로 변경되기 어려운 구조를 가지고 있기 때문에 입니다.

광학 구조 설명

KÖHLER ILLUMINATION은 현미경 광 경로 상에 2개의 결상계가 서로 결상 되지 않는 영역을 상보적으로 사용하도록 설계되어 있다.

1st. 샘플의 상이 형성되는 결상계

첫째로는 샘플의 상이 형성되는 이미징용 결상계

• Conjugate Field Planes
• 샘플의 상이 결상 되는 위치
  • 접안렌즈의 Intermediate Image
  • 접안렌즈로 관찰시 눈의 시신경
  • Field Stop Diagphragm

2nd. 조명 광원이 형성되는 결상계

두번째로는 조명 광원의 상이 형성되는 결상계

• Conjugate Aperture Planes
• 조명 광원이 결상 되는 위치
  • 콘덴서의 전초점면(Front Focal Plane) 또는 Aperture diaphragm
  • 대물렌즈의 후초점면(Rear Focal Plane),
  • 접안렌즈 다음의 홍재조리개 이다. 참고로 시신경에 상이 결상하는 것이 아니기 때문에 형상을 인지 할 수 없습니다.

위상차 현미경 관찰법

Phase contrast Microscopy

• 위상차 관찰법 발명자 정보

Frits Frederik Zernike(네덜란드 과학자)

위상차 현미경 발명으로 노벨물리학상(1953)을 수상.

•  발명 배경

  생물현미경에서 사용하는 대부분의 샘플은 무색투명한 특성을 가지고 있기때문에,  배율확대 만을 목적으로 하는 일반 현미경의 관찰법(Bright Field)에서는 투명하고 윤곽이 흐릿하게 보이기 때문에 제대로 된 관찰에 어려움이 있습니다.

  이 문제를 해결하기 위하여 샘플을 염색하는 방법이 사용하고 있습니다만,  이 방법으로는 살아있는 샘플의 관찰은 할 수 없습니다. 염색 도중에 샘플이 죽어버리기 때문입니다.

• 위상차 현미경의 (개요)

위상차 관찰법(Phase-Contrast)은 샘플을 통과하는 직진광(하단 좌측 이미지)과 이 직진광이 샘플에 통과하면서 발생하는 회절광(하단 우측 이미지) 사이의 위상차 현상을 이용하여 살아있는 세포의 구조와 미생물의 상태변화를 볼게 있게 해주는 관찰법입니다.

• 위상차 현미경의 원리 설명

  샘플의 한 포인트(샘플 평면 중의 한 점)를 통과하는 빛은 두 개의 광학 경로를 가지도록 설계 되어 있으며, 이 두개의 경로를 통과한 빛은 한점에 다시 한 점에 모여 확대된 상을 만들게 되지만, 다른 경로를 지나왔기 때문에 발생한 위상차에 의하여 보강 또는 소멸 간섭을 하게 된다.

  하단의 좌측이미지는 두개의 광학경로 중에 직진광의 경로이며, 하단의 우측이미지는 직진광이 샘플에 닿을때 발생하는 회절광의 경로이다. 참고로 직진광이 샘플이 없는 포인트를 지나가게 되면 산란이 생기지않아 회절광은 발생하지 않는다.

  회절광은 직진광의 위상에 비교하여 대략 1/4λ 지연되어 결상한다. 직진광은 위상판에 의하여 1/4λ 또는 3/4λ지연되어 결상한다.

  직진광이 위상판에 의하여 1/4λ 지연되어 회절광과 동일한 위상을 갖게 되면 직진광과 회절광의 위상이 서로 보강간섭을 하여 진폭이 커지게 되면 배경에서는 직진광의 영향만 받기 때문에 샘플이 배경 보다 밝게 보인다. (Negative contrast)

  반대로  직진광이 위상판에 의하여 위상이 3/4λ 지연되면 직진광과 회절광은 소멸 간섭을 하게 되어 샘플은 직진광의 영향만 받는 배경보다 어둡게 보인다. (Positive contrast)